Šta je to ELISA?

U kontekstu testiranja na COVID-19, posebice seroloških testova (testova na antitijela) možda ste mogli čuti kako se pominje termin ELISA (čita se elajza) testovi. Ako i niste čuli to, bilo bi vrijedno da zapamtite pojma jer se radi o važnoj alatki u biologiji i medicini.

Dakle, ako redovno pratite ovaj nesretni, nepopularni i dosadni blog, vjerovatno ste pročitali u članku o serološkim testovima kako postoje "brzi" testovi i ELISA testovi, koje se rade u laboratorijskim uslovima. Brzi serološki testovi - "Brzi Gonzales" zaista jesu brzi, nalikuju onim testovima za trudnoću, ali imaju problem što su često neprecizni, odnosno niža im je senzitivnost i specifičnost te u većoj mjeri mogu davati lažno pozitivan ili lažno negativan rezultat. To znači da vam mogu pokazati da ste imali COVID-19, a zapravo niste, ili pokazati da niste imali., a zapravo ste ga preboljeli. 

S druge strane, tu su ELISA testovi koji su nešto sporiji, zahtijevaju da se rade u laboratoriji, ali su mnogo senzitivniji i specifičniji. Odnosno, neće vas lažno optužiti niti izvijestiti da nemate antitijela, a u stvari imate. ELISA - bazirana dijagnostika se koristi i za dokazivanje da je osoba oboljela od nekih drugih infekcija - od AIDS/SIDA, od hepatitisa B i C za druge bolesti, ali ne samo u medicinskoj i veterinarskoj dijagnostici. Recimo, koristi se za dokazivanje prisustva nekog alergena u hrani i slično.  

Dakle, šta znači ELISA? To je akronim od enzyme-linked immunosorbent assay i predstavlja jednu od najvažnijih metoda biohemijske analize. Ovo ispitivanje koristi enzim u čvrstoj fazi za otkrivanje prisutnosti nekog specifičnog liganda (obično proteina) u tekućem uzorku koristeći antitijela usmjerena protiv proteina koji se mjeri. 

Dakle, strani proteini (recimo "spike" protein SARS-CoV-2) pobude imunološku reakciju našeg tijela da ono proizvodi antitijela. Ne zaboravite da su i sama antitijela proteini, što znači da ih možemo detektovati s ELISA. U ovisnosti o dizajnu, ELISA test može detektivati i antigene i antitijela, već šta nam u datom slučaju treba. Recimo, za dokazivanje toga da je neko imao COVID-19, mi ćemo ELISA testom tražiti antitijela koje je organizam proizveo na SARS-CoV-2 (tj. na neke proteine kapside virusa), a u drugim slučajevima možemo tražiti antigen - recimo toksin neke bakterije ili alergen. 

To znači da je ELISA test na svaku posebnu tvar posebno dizajniran i ima poseban protokol koji pratite.

ELISA test također kvantificira koliko toga ima u uzroku (recimo u uzorku krvnog seruma). Tako možemo odrediti koliko su nam jaki titri antitijela nakon vakcinacije. 

Ovo treba zapamtiti - ELISA test je visokospecifičan test koji detektuje i kvantificira peptide (kraći lanci aminokiselina, kraći od proteina), proteine (tako i antitijela), ali čak i hormone (koji su često upravo peptidi ili proteini). 

Kod ELISA-testiranja, antigen se mora imobilizirati na čvrstu površinu, a zatim složiti s antitijelom vezanim za enzim - otuda i naziv testa. Detekcija se provodi procjenom aktivnosti konjugiranog enzima inkubacijom sa supstratom, da se dobije mjerljivi proizvod. Najvažniji element strategije otkrivanja je visoko specifična biohemijska interakcija antitijelo-antigen.

ELISA se tipično izvodi na polistirenskim pločama s 96 "jažica"  (ima ih i sa manje, ali i sa  čak 384 jažice, pogledajte sliku kako to izgleda), koje će pasivno vezati antitijela i proteine. 

ELISA na polistirenskoj ploči s 96 jažica

Kada u uzorak koji ispitujemo dodamo specifična antitijela, ako u uzorku ima toga što želimo detektovati, antitijela će se vezati za tu tvar (antigen) i neće se pri ispiranju ELISA ploče isprati. 

Upravo to vezanje i imobilizacija reagensa čini ELISA-ove tako jednostavnom za dizajn protokola i izvedbu. Reaktanti ELISA imobiliziraju na površini mikroploče  i to olakšava odvajanje vezanih materijala od nepovezanih materijala tijekom ispitivanja. Ova sposobnost ispiranja nespecifično vezanih materijala čini ELISA moćnim alat za mjerenje specifičnih tvari.  Dakle - sve što je nespecifično vezano se ispere i nestane, ostane samo ono što smo trebali. Postoje različiti porotokoli ELISA za različite svrhe, ali princip im je isti, samo su optimizirani upravo za taj neki specifični protein. 

Reakcija antigen-antitijelo je vidljiva kao promjena boje. Ponekad ova promjena nije vidljiva golim okom, pa koristimo spektrofotometar da je detektujemo i kvantificiramo.