Usavršavanje tehnologije CRISPR

Medijima u svijetu su puna usta CRISPR/Cas 9 tehnologije. Naši mediji tu i tamo površno spomenu ovu tehnolgiju editovanja DNK. Kada sam prije možda godinu dana jednog našeg vrlog genetičara pitala šta su to tačno Clustered regularly-interspaced short palindromic repeats (=CRISPR), nije mi znao odgovoriti, nije nikad ni čuo za to. Nadam se da je ovaj termin danas poznat svim genetičarima u regionu, to je novi big-crush biotehnolgije - svi su zaljubljeni u CRISPR. Osim što CRISPR sistem može izrezati neko pogrešno slovo, on može i u DNK ugraditi ispravnu sekvencu, ako samo brisanje nije dovoljno.

Nisam jednom pisala o ovoj tehnologiji, koja je bazirana na enzimima za reparaciju DNK kod prokariota. Nisam jednom pisala ni o nedostacima  ove tehnologije: o opasnosti od off-target promjena na DNK, koje su neka vrsta kolateralne štete upotrebe CRISPR. Zašto je tako? Genomi ne vole da ih se dira i kada ih se rastavi, oni se pokušavaju ponovo sastaviti, uzimajući azotne baze A,C,T i G iz okoline u kojoj se nalaze. Genetičari vole ovo porediti sa pokušajem da se super-ljepilom zalijepi skrhana skupa vaza.

Dakle, bit je sljedeće: pomoću ove tehnologije moglo bi se mijenjati samo jedno pogrešno "otkucano" slovo na DNK. Upravo ove tačkaste, "point" mutations mogu biti jako opasne i dosta kongenitalnih poremećaja nastaje upravo zbog svega jednog promijenjenog slova. Neki od ovih poremećaja su cistična fibroza, neke vrste kancera, neurofibromatoza, srpasta anemija, Tay-Sachsova bolest, fibrodisplazija osifikans progresiva, čak i sljepilo za boje.

Međutim, problem je što bi CRISPR jednu mutaciju ispravio, ali bi prouzrokovao niz drugih, sa neočekivanim i neistraženim posljedicama. Tako bi se liječenje CRISPR pretvorilo u ono što profesor sa Harvarda George Church naziva "genomskim vandalizmom".

Stoga su naučnici iz ove domene usmjerili svoj rad na usavršavanje CRISPR tehnologije tako da se izbjegnu off-target mutacije. U radu objavljenom u Nature 20.4. 2016. pokazano je kako CRISPR može može efikasnije i čistije mijenjati sekvencu DNK.

Autori ovog rada, Alexis Komor i njegove kolege su zamijenile ključni enzim u ovom procesu, Cas9, sa "mrtvim Cas 9" (dCAs9).  U radu stoji:

"Catalytically dead Cas9 (dCas9), which contains Asp10Ala and His840Ala mutations that inactivate its nuclease activity, retains its ability to bind DNA in a guide RNA-programmed manner, but does not cleave the DNA backbone."

Jasno je da je jedan asparagin u enzimu zamijenjen alaninom, a jedan histidin također alaninom, te je zbog toga enzim neaktivan, ne siječe DNK, ali zadržava sposobnost da se na nju veže. Zatim su naučnici na DNK prikačili druga dva proteina koji također mogu mijenjati slova na DNK. Od 12 mogućih zamjena slova (A u T, C u G, G u C...), novi sistem može načiniti dvije promjene: C promijeniti u T i promijeniti G u A.

To se možda ne čini kao nešto mnogo, ali treba znati da je oko 3000 nasljednih poremećaja uzrokovano zamjenom C tamo gdje treba biti T i postojanjem G tamo gdje treba biti A. Dakle, novi sistem može vratiti stvari u "pravilan" položaj. Naučnici su blizu da uspiju napraviti sisteme koji će vršiti i ostali 10 promjena. 

Naučnici su ovaj sistem testirali na miševima koji nose humani gen povezan sa Altzeimerovom bolesti. Ovaj gen, APOE4 se od zdravog gena razlikuje samo u jednom slovu. Novi sistem je uspio promijeniti slovo u čak 75% stanica. Međutim, i ovaj sistem ima mane: ako sekvenca glasi ACTGACC, a samo je posljedni citozin onaj na kojeg treba djevati i promijeniti ga u T, sistem će promijeniti i pretposljednje C u T i izazvati novu mutaciju :(

Ipak, ovaj novi sistem editovanja je potecijalno moćna tehnologije i, premda su ovo još rani radovi, na CRISPR treba držati sve oči otvorene i pratiti dešavanja iz ove oblasti jer-biće zanimljivo.